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pgadt7（pgadt7載體）

發(fā)布時間：2023-06-13 00:19:30 稿源：創(chuàng)意嶺閱讀： 128

大家好！今天讓創(chuàng)意嶺的小編來大家介紹下關于pgadt7的問題，以下是小編對此問題的歸納整理，讓我們一起來看看吧。

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本文目錄:

請教質粒pGADT7-Rec-AD的序列分析
為什么pgbkt7與pgadt7共轉之后在三缺培養(yǎng)基上能長
酵母雙雜交實驗有哪些注意事項

pgadt7（pgadt7載體）

請教質粒pGADT7-Rec-AD的序列分析

從你的前一個基因的ATG開始往后看，如果后一個基因的ATG編碼正確，那就沒有移位。。
如果少了一個，或者2個，設計引物時，要在ATG前相應補上。。追問

老師，再打擾您一下。
是這樣的，用SMART技術合成雙鏈cDNA時，用的SMART III Oligo (10 μM; 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3')，它的末端是GGCCGGG。但是原來的pGADT7-Rec序列是GGCCCGGG，重組后的質粒pGADT7-Rec-AD的序列依然是GGCCGGG。這樣測得的基因序列如何知道編碼框有無移位呢?非常感謝！

為什么pgbkt7與pgadt7共轉之后在三缺培養(yǎng)基上能長

三缺培養(yǎng)基上，有必要的條件
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如果你對這個答案有什么疑問，請追問，
另外如果你覺得我的回答對你有所幫助，請千萬別忘記采納喲！
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酵母雙雜交實驗有哪些注意事項

注意事項
（1）酵母雙雜交對照的設定常規(guī)的酵母雙雜交操作時一般會設定陽性對照、陰性對照以及顯色系統(tǒng)對照三種對照，以MATCHMAKER GAL4酵母雙雜交篩選系統(tǒng)為例：
陽性對照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已經(jīng)明確在酵母細胞內能夠發(fā)生結合并啟動報告基因表達的兩種蛋白。
陰性對照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已經(jīng)明確T蛋白和lam蛋白在酵母細胞內不能發(fā)生結合。系統(tǒng)顯色對照，pGADT7-Pcl1，該表達質粒轉入酵母細胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶的分泌，從而檢測顯色系統(tǒng)是否有問題。
（2）假陽性現(xiàn)象多種原因可能造成假陽性結果，常見的有以下三種：
篩到的文庫蛋白自身具有轉錄活性，能夠啟動報告基因的表達——這種情況需要對篩到的候選蛋白進行自激活驗證。
酵母細胞內可能同時含有不止一種文庫蛋白，其中的一種文庫蛋白可以與誘餌蛋白相互及結合。
這種情況需要對陽性克隆再次劃板2~3次，以確保每一個酵母克隆中只含有一種文庫蛋白和誘餌蛋白；另外劃板的次數(shù)也不宜過多，否則會出現(xiàn)蛋白表達質粒丟失的情況。其他一些不明原因造成的假陽性—這種情況需要將篩到的候選文庫質粒和表達誘餌蛋白的質粒重新共轉入酵母細胞或者通過酵母雜交的方式重新驗證，如有必要可以將pGADT7-cDNA質粒與pGBKT7-bait質粒的載體對調構建成pGADT7-bait與pGBKT7-cDNA并重新在酵母細胞中驗證，真正的陽性結合在對調以后也能在酵母細胞中做出陽性結果。
（3）常見的問題及參考方案轉化效率過低—盡量使用新鮮的培養(yǎng)基以及新鮮的、且直徑大小在2~3 mm左右的酵母克隆，以確保酵母的活力；可將用于轉化的質粒在使用前進行乙醇沉淀，以提高質粒的純度和濃度。
雜交效率偏低—可能由于表達的融合蛋白對酵母細胞有毒性，在某些情況下在液體培養(yǎng)基中生長不好的酵母換到瓊脂糖固體培養(yǎng)板上時，會生長得比較好，這種情況可以采用共轉化的方法進行試驗；或者將單轉的酵母克隆分別鋪到5塊10 mm的培養(yǎng)板上，待克隆長出來以后，刮取所有克隆于5 mL 0.5×YPDA中。重懸后再按照常規(guī)雜交操作步驟進行操作。背景過高—當使用HIS3作為報告基因時，由于HIS3基因具有一定程度的泄漏表達，可能會出現(xiàn)背景過高的情況，這時可以使用適量的HIS3蛋白競爭性抑制劑3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一種更加嚴格的報告基因的篩選如Ade。
誘餌蛋白具有自激活現(xiàn)象——可以采用克隆突變的方法將產生自激活一段氨基酸序列敲除或突變，但這種方法可能會破壞兩蛋白之間的相互作用。

pgadt7（pgadt7載體）